Vijftigduizend jaar geleden ontlastte een neanderthaler zich in de Trou Al'Wesse-grot in de provincie Luik, en hij liet daarbij, onder meer, een staal van zijn DNA achter. Zijn urine verbond zich met mineralen in de grond, en zijn ontlasting desintegreerde uiteindelijk, maar sporen van zijn DNA bleven achter, ingebed in de grond van de grot.

Nu heeft een internationaal team van onderzoekers van het Max-Planck-Institut fur evolutionäre Anthropologie in Leipzig aangetoond dat ze die genetische sporen van zowel neanderthalers als denisova-mensen kunnen terugvinden in de grond en identificeren. Dat laat hen toe grotten te testen op de aanwezigheid van oermensen, zelfs grotten en vindplaatsen waar nooit beenderen gevonden zijn, zoals de Trou Al'Wesse-grot. Daar zijn wel werktuigen en beenderen van uitgestorven dieren gevonden, maar nooit menselijke beenderen.

Tot nu toe was de enige manier om de genen van oude mensensoorten als de neanderthalers en de mysterieuze denisova-mensen te onderzoeken, DNA te onttrekken aan fossiele beenderen. Nu kan dat dus ook met DNA uit de grond. 

Onderzoekers zeggen dat het oude DNA uit de sedimenten hen zal helpen om de kaart van de oude menselijke bewoning te vervolledigen, en hen toe zal laten om te zien waar mensensoorten overlappende leefgebieden hadden, en met elkaar in contact kwamen en interacties hadden met elkaar.

Veel onderzoekers denken dat de nieuwe techniek in de toekomst een standaardinstrument zal worden in de paleo-archeologie, net zoals de radiokoolstofdatering of C14-methode dat nu al is.

De onderzoekers verzamelden 85 stalen van sedimenten uit zeven grotten in Europa en Azië waarvan geweten is dat mensen er zijn binnengegaan, of zelfs geleefd hebben, in het pleistoceen, tussen 14.000 en 550.000 jaar geleden.

Het team van het Max-Planck-Institut onder leiding van Matthias Meyer was in staat om specifiek op zoek te gaan naar genetisch materiaal van oude mensensoorten en andere zoogdieren, door een methode te verfijnen die tot dan toe gebruikt werd om DNA van planten en dieren te vinden.

Hoewel DNA zich vasthecht aan mineralen en vergane planten in de grond, wisten de onderzoekers niet of het ooit mogelijk zou zijn om fragmenten van genen op te vissen die tienduizenden jaren oud zijn, en die diep begraven liggen tussen ander genetisch afval. De stukjes genen van oude mensensoorten maken immers slechts een miniem deel uit van het DNA dat in de natuurlijke wereld rondhangt.

Maar het team van Meyer heeft jarenlang methoden ontwikkeld om DNA te vinden, zelfs daar waar het onmogelijk leek omdat het zo schaars en gedegradeerd was.

Doctor Meyer en zijn team zocht eerst uit welk DNA in het sediment uit de grotten prehistorisch was, door te kijken naar kenmerkende tekenen van degradatie aan het uiteinde van de moleculen.

Vervolgens plukten ze uit dat prehistorische DNA het DNA van neanderthalers en denisova-mensen met een moleculaire haak om genen te vangen van de mitochondriën die uniek zijn voor deze mensensoorten. Mitochondriën zijn de "energiefabriekjes" van de cellen, ze worden alleen via de moeder doorgegeven, en ze komen alleen in het cytoplasma voor, het deel van de cel buiten de celkern. Mitochondriaal DNA is heel geschikt voor wat de onderzoekers zochten, omdat nauw verwante soorten er toch mee van elkaar kunnen onderscheiden worden.

De onderzoekers bouwden ook een geautomatiseerd systeem om de stalen snel te kunnen onderzoeken. Op de klassieke manier, met de hand en met pipetten, zou het verschillende dagen duren om nog maar een fractie van het aantal stalen te analyseren.

De groep had die efficiëntie nodig. Uit de verschillende stalen aarde haalden ze tussen 5.000 en 2,8 miljoen DNA-fragmenten. Het aantal DNA-fragmenten dat afkomstig was van oude mensensoorten daarin was minuscuul en varieerde van 0 tot 8.822.

Het team van Meyer was in staat om het DNA te identificeren van verschillende dieren die tot 12 families van zoogdieren behoren, waaronder ook uitgestorven soorten als de wolharige mammoet, de wolharige neushoorn, de holenbeer en de grottenhyena.

In de sedimenten van vier archeologische sites vonden ze DNA van neanderthalers, en dat ook in lagen waar nooit menselijke beenderen gevonden zijn. Zoals gezegd was dat onder meer het geval in de Belgische Trou Al'Wesse-grot.

Daarnaast vonden ze ook nieuwe stalen van DNA van de mysterieuze denisova-mens in de Denisova-grot in Siberië.

Volgens de onderzoekers moet het met de techniek ook mogelijk zijn om niet alleen mitochondriaal DNA te vinden, maar ook "aanzienlijke delen van het genoom van de celkern".  

Het enthousiasme bij paleontologen en genetici over de nieuwe techniek is groot. "Het is een beetje als ontdekken dat je goudstof kunt onttrekken aan de lucht", zei populatie-geneticus Adam Siepel van Cold Spring Harbor University aan de "New York Times".

"De ontdekking dat het nu mogelijk is om dit allemaal te doen, is verbazingwekkend", zei professor genetica David Reich van Harvard, eveneens aan de New York Times. Volgens hem zijn de vragen die nu aangepakt kunnen worden, bijna eindeloos.

Zo zou het logisch zijn dat onderzoekers beginnen te zoeken naar beenderen in grotten waar DNA in het sediment aantoont dat er ooit oermensen hebben gewoond.

En het lijkt waarschijnlijk dat de onderzoekers veel meer te weten zullen komen over de menselijke prehistorie, onder meer over de denisova-mensen. Die kennen we nu alleen door hun DNA dat uit een beperkt aantal beenderen is gehaald die in één grot in Siberië zijn gevonden. Maar kleine delen van hun genen worden wel aangetroffen bij moderne mensen in Papoea-Nieuw Guinea, Melanesië en bij de aboriginals in Australië. Mogelijk kan de nieuwe techniek een antwoord geven op de vraag hoe die genen daar geraakt zijn, en waarom ze bij die mensen worden aangetroffen en niet bij mensen dichter in de buurt van Siberië.

Een andere mogelijke toepassing van de techniek is volgens professor Reich dat men kan beginnen zoeken naar DNA van oermensen in sites in openlucht, in plaats van naar beenderen te zoeken in grotten.

"Als dat werkt, zou het een veel rijker beeld opleveren van de geografische verdeling en de migratiepatronen van de oermensen, een beeld dat niet beperkt wordt door het kleine aantal beenderen dat gevonden wordt", zo zei Reich. "Dat zou werkelijk magisch zijn."

Wel kan er een probleem zijn met de datering van de DNA-vondsten in de sedimenten. Eske Willerslev, een van de pioniers in de zoektocht naar DNA in sedimenten, die niet betrokken was bij deze studie, zei aan "The Telegraph" dat de nieuwe studie interessant was, maar hij waarschuwde er voor dat het moeilijk is om vast te stellen hoe oud stalen van sedimenten uit grotten zijn.

"Over het algemeen zijn de sedimenten erg verstoord, en als je niet kan aantonen dat dat niet het geval is, heb je geen idee van de ouderdom van de vondsten", zei Willerslev, een evolutionair geneticus aan de Universiteit van Kopenhagen.

Dat neemt niet weg dat de nieuwe techniek veel mogelijkheden biedt. "In principe biedt elke grot waar er aanwijzingen zijn van menselijke activiteit nu de mogelijkheid om de nieuwe procedure te gebruiken", zei projectleider Meyer aan het persagentschap AP. 

De studie van Meyer en zijn team is gepubliceerd in het wetenschappelijk tijdschrift "Science".

Sinds hun ontdekking in 2010 zijn de uitgestorven mensen die denisovamensen genoemd worden, nagenoeg enkel bekend van hun DNA. Dat is uit een vingerkootje, twee tanden en een voetbeentje gehaald die in de Denisova-grot in Siberië zijn gevonden, samen met verschillende werktuigen.

Sindsdien zijn er ook sporen van dat DNA gevonden in het DNA van moderne, niet-Afrikaanse mensen, waaruit blijkt dat die zich ooit vermengd moeten hebben met de denisovamensen. En uit het DNA van de denisovamensen blijkt dan weer dat die zich vermengd hebben met zowel neanderthalers als met Homo sapiens, moderne mensen.

De tanden uit de Denisova-grot lijken niet op die van neanderthalers en evenmin op die van moderne mensen, maar meer op die van de archaïsche Homo erectus, het vingerkootje is erg breed en robuust, maar voor de rest weten we absoluut niet hoe de denisovamensen er uitgezien hebben.

Daar komt nu misschien verandering in, want twee schedels die recent in het oosten van China gevonden zijn, worden omschreven als "uitstekende kandidaten" om ons te tonen hoe die schimmige mensen uit de IJstijd er uitgezien kunnen hebben.

In december 2007 liep het opgraafseizoen ten einde voor onderzoeker Zhan-Yang Li van het Instituut voor Paleontologie van de Gewervelden en Paleo-anthropologie (IVPP) in Peking. Zhan-Yang Li verrichtte opgravingen in de stad Lingjing, nabij de stad Xuchang in de Henan-provincie, zo'n 4.000 kilometer van de Denisova-grot in Siberië, en op de laatste dag zag hij enkele prachtige werktuigen uit kwarts uit het sediment steken op het opgravingsveld. 

Hij besloot de opgravingen met twee dagen te verlengen om de werktuigen te kunnen bergen, en op de allerlaatste ochtend vond zijn team een geel stukje schedel in de modderige bodem van de put waar men aan het graven was, in dezelfde laag waar ook de werktuigen gevonden waren.

Het team keerde de volgende jaren terug naar de opgravingssite en slaagde er in om in de volgende zes seizoenen nog 45 stukjes schedel te vinden die samen twee gedeeltelijke schedels vormen, het aangezicht en de kaken ontbreken jammer genoeg.

Hoewel de voorkant en de kaken ontbreken, heeft het team genoeg stukken van de schedels gevonden om een nauwe gelijkenis met de neanderthalers vast te stellen. Maar de schedels vertonen ook andere kenmerken, en de onderzoekers hebben de schedels, met hun mengeling van archaïsche, moderne en tussenliggende kenmerken, en met kenmerken van zowel neanderthalers als van moderne mensen, Homo sapiens, omschreven als een "mozaïek van morfologische kenmerken".

Een van de schedels heeft een enorme herseninhoud van 1.800 kubieke centimeter - dicht bij de bovengrens voor zowel Neanderthalers als moderne mensen -, en een neanderthal-achtige holte in een been aan de achterkant van de schedel. De beide schedels hebben uitspringende wenkbrauwbogen en beentjes uit het binnenoor die lijken op die van neanderthalers en niet op die van de moderne mens.

De schedels verschillen echter ook van die van de westelijke neanderthalers uit Europa en het Midden-Oosten. Zo hebben ze dunnere wenkbrauwbogen en minder stevige schedelbeenderen, die overeenkomen met die van vroege moderne mensen en enkele andere Aziatische fossielen. "Het zijn niet ten volle neanderthalers", zei mede-auteur Erik Trinkaus in Science. Trinkaus is paleontoloog aan de Washington University in St. Louis, Missouri.

En de nieuwe fossielen zijn evenmin laat voorkomende exemplaren van andere, oudere archaïsche mensensoorten zoals Homo erectus of Homo heidelbergensis, twee soorten die voorouders zijn van de neanderthalers, moderne mensen en denisovamensen.

Wel hebben ze een aantal kenmerken gemeen met andere fossielen uit Oost-Azië, die dateren van 600.000 tot 100.000 jaar geleden, en die niet makkelijk te klasseren zijn, zei paleo-anthropoloog Rick Potts van het Smithsonian Museum of Natural History in Washington D.C. Tot die kenmerken behoort een brede schedelbasis op het punt waar de schedel op de ruggengraat zit, en een lage platte plaat op de bovenkant van de schedel.

De schedels uit Lingjing lijken ook op een andere archaïsche menselijke schedel van zo'n 100.000 jaar oud uit Xujiayao in het Nihewan-bassin in China, zo'n 850 kilometer meer naar het noorden, zei medeauteur Xiu-Jie Wu, een paleo-anthropoloog aan het IVPP.

In de publicatie van de schedels in "Science" zegt Wu dat die oudere vondsten en de nieuwe schedels "een soort van onbekende of nieuwe archaïsche mens zijn, die in Oost-Azië overleefd heeft tot 100.000 jaar geleden". Op basis van de gelijkenissen met een aantal andere Aziatische fossielen, denkt zij en haar collega's dat de nieuwe schedels toebehoren aan regionale leden van een populatie in het oosten van Azië die generaties lang lokale kenmerken doorgegeven heeft, in wat de onderzoekers "regionale continuïteit" noemen. Tegelijkertijd wijzen de gelijkenissen met zowel de neanderthalers als de moderne mensen er op dat deze archaïsche Aziaten zich minstens "op een laag niveau" vermengd moeten hebben met andere archaïsche mensen.

Zelf gebruiken de onderzoekers in hun publicatie van de nieuwe schedels in Science het woord "denisovamens" niet, maar andere wetenschappers doen dat wel en Ann Gibbons van Science zet ze in hetzelfde nummer op een rijtje.

"Iedereen anders zou zich afvragen of dit denisovamensen zouden kunnen zijn", zei paleo-anthropoloog Chris Stringer van het Natural History Museum in Londen.

De nieuwe schedels passen "absoluut" in het plaatje van wat men zou verwachten van een denisovamens, zei paleo-anthropoloog María Martinón-Torres van het University College London, - "iets met een Aziatische smaak maar nauw verwant aan neanderthalers". Maar omdat de onderzoekers geen DNA uit de schedels gehaald hebben, "blijft de mogelijkheid een speculatie".  Paleogeneticus Qiaomei Fu van het IVPP zegt dat ze geprobeerd heeft DNA te extraheren uit drie verschillende stukken van de schedels, maar dat het niet gelukt is.

Volgens Jean-Jacques Hublin van het Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology in Leipzig voldoen de denisovamensen aan de beschrijving die de auteurs geven van de mensen aan wie de schedels hebben toebehoord, als een populatie archaïsche mensen die generaties lang lokale kenmerken hebben doorgegeven en zich ook vermengd hebben met neanderthalers en moderne mensen. "Dat is precies wat het DNA ons vertelt als je probeert wijs te worden uit de Denisova-ontdekkingen", zei hij in Science. "Deze Chinese fossielen bevinden zich op de juiste plaats op de juiste tijd, en ze hebben de juiste kenmerken."

Wu en Trinkaus die de vondsten gepubliceerd hebben, zeggen echter dat ze de fossielen niet in een groep kunnen plaatsen die enkel gedefinieerd wordt door DNA. "Ik heb er geen idee van wat een denisovamens is", zei Trinkaus. "En ook niemand anders weet het. Het is een DNA-sequentie."

Wat de juiste identificatie van de nieuwe schedels ook moge zijn, ze tonen een veel meer verward beeld dan het algemeen aanvaarde idee van aparte populaties, die grotendeels onafhankelijk van elkaar en naast elkaar geleefd hebben, en de schedels werpen nieuwe vragen op bij de "out of Africa"-theorie, die zegt dat Homo sapiens in Afrika ontstaan is en zich tussen 100.000 en 50.000 jaar geleden van daaruit over de wereld verspreid heeft.

Sommige wetenschappers stellen dat de moderne mens tegelijk ontstaan is in Afrika en op verschillende plaatsen in Eurazië door vermenging met gemeenschappelijke voorouders, en dat de moderne mens dus een "hybride" is.

“Ik beschouw deze fossielen niet graag als hybriden", zei Erik Trinkaus aan News.com.au. “Hybridisering houdt in dat al deze groepen apart en afzonderlijk waren, en slechts occasioneel interacties kenden. Wat deze fossielen tonen is dat deze groepen in essentie niet apart stonden. Het idee dat er afzonderlijke afstammingslijnen waren in verschillende delen van de wereld, wordt meer en meer tegengesproken door de aanwijzingen die we opgraven."

"China herschrijft het verhaal van de menselijke evolutie", zei Martinón-Torres. "Ik vind dat enorm opwindend."

http://deredactie.be/cm/vrtnieuws/wetenschap/1.2909141

In 2013 deden Lee Berger van de University of Witwatersrand in Johannesburg en zijn collega's een spectaculaire ontdekking in een aardedonkere grot, diep in het "Rising Star Cave"-systeem in Maropeng, niet ver van Johannesburg. Ze vonden er de resten van een nieuwe mensensoort, Homo naledi. In totaal zouden ze 1.550 beenderen en fragmenten van beenderen vinden van minstens 15 individuen.

Tegen 2015 was het duidelijk dat de nieuwe soort in niets leek op eerdere ontdekkingen. Want hoewel delen van het skelet er identiek uitzagen aan onze moderne anatomie, had Homo naledi ook een aantal kenmerken die opvallend primitief waren - onder meer een schedel die slechts iets groter was dan die van een chimpansee.

Berger en zijn team beten hun tanden stuk op de vraag hoe oud de fossielen wel waren. Zonder die informatie waren de meeste onderzoekers het erover eens dat het onduidelijk was welke belang Homo naledi had om tot een beter begrip te komen van de menselijke evolutie. De schattingen van de ouderdom liepen uit elkaar van 2,8 miljoen jaar tot slechts 100.000 jaar.

Nu heeft het team van Berger echter bekendgemaakt dat het eindelijk een manier gevonden heeft om de fossielen te dateren. In een interview met "National Geographic" heeft Berger onthuld dat de fossielen van Homo naledi tussen 300.000 en 200.000 jaar oud zijn.

Meer bijzonderheden over hoe de datering gebeurd is, ontbreken nog. "The New Scientist" heeft in afwachting daarvan al een aantal implicaties van de datering op een rijtje gezet.

Soms kan het verrassend moeilijk zijn om fossiele beenderen te dateren. Voor veel dateringstechnieken is isotopische analyse op stalen van beenderen noodzakelijk. Berger en zijn team stonden daar weigerachtig tegenover, omdat het zou betekenen dat - weliswaar kleine - stukjes van het waardevolle fossiele materiaal vernietigd zouden worden.

Een andere optie is het dateren van de rotsen of sedimenten die de laag bedekken waarin de fossielen gevonden zijn. Oude afzettingen van lava in het bijzonder zijn erg geschikt voor isotopische datering. Maar de overblijfselen van Homo naledi werden gevonden in een grot waarin er geen makkelijk te dateren laag was die de fossielen bedekte.

Nog een mogelijkheid om een ruwe schatting van de ouderdom van fossielen te maken, is kijken naar de fossiele overblijfselen van andere soorten die er samen mee gevonden worden, als de ouderdom van die soorten al bekend is. Maar de grot waarin Homo naledi gevonden werd, bevatte bijna geen beenderen van andere soorten, dus dat was hier ook niet mogelijk.

Het is nog niet geweten hoe Berger en zijn team de fossielen uiteindelijk hebben kunnen dateren, aangezien de wetenschappelijke studie met die informatie nog niet gepubliceerd is. In het interview met "National Geographic" wordt wel gezegd dat Berger en zijn collega's een tweede kamer in de grot hebben gevonden met overblijfselen van Homo naledi. Mogelijk zijn die nieuwe fossielen bewaard gebleven in een context waar een datering wel mogelijk was.  

Onze oudste voorvaders uit de Hominini-groep leefden minstens 7 miljoen jaar geleden. De eerste soorten die er een beetje uitzagen zoals moderne mensen verschenen dan weer tussen 2 en 3 miljoen jaar geleden.

Maar onze eigen soort, Homo sapiens, verschijnt pas op het toneel zo'n 200.000 jaar geleden. 

Als Homo naledi dus zo'n 300.000 tot 200.000 jaar geleden geleefd heeft, is dat een opmerkelijke ontdekking. Het betekent dat een soort van mens met verrassend primitieve kenmerken - onder meer een erg kleine schedel en een erg klein brein - overleefd heeft tot in het recente verleden. "Recent" in evolutionaire zin dan. 

En het is dan zelfs denkbaar dat Homo naledi vroege leden van onze soort, Homo sapiens, ontmoet heeft, en men kan zelfs speculeren dat onze soort er iets mee te maken heeft gehad dat Homo naledi uitgestorven is.  

Dat hangt er maar van af aan wie je het vraagt. Louter op basis van zijn vreemde anatomie lijkt Homo naledi ergens in de buurt van de basis van de stamboom van de "echte mensen" te horen, een idee dat men terugvindt in een aantal studies van de fossielen.

Maar we weten dat de eerste vroege mensen meer dan twee miljoen jaar geleden op aarde verschenen. Als Homo naledi maar 300.000 jaar oud is, zullen sommige onderzoekers argumenteren dat hij niet kan thuishoren aan de basis van onze stamboom, omdat Homo naledi daar te jong voor is. Misschien had hij wel een modern uitziende voorouder, en heeft hij later primitief uitziende kenmerken ontwikkeld.

Toch is het nog steeds perfect mogelijk dat Homo naledi echt wel thuishoort in de buurt van de basis van onze stamboom. De soort kan zich immers meer dan 2 miljoen jaar geleden ontwikkeld hebben als een van de eerste "echte" mensen, en dan overleefd hebben, onveranderd, gedurende honderdduizenden jaren.

Berger heeft eerder al eens gezinspeeld op die mogelijkheid. Hij zegt dat Homo naledi een menselijke versie van de "coelacant" zou kunnen zijn, een primitieve vis met voorvaderen die voor het eerst opdoken 400 miljoen jaar geleden, en die vandaag nog steeds gevonden wordt in de oceanen.

Misschien wel. Zo'n 10 jaar geleden deden onderzoekers aan de andere kant van de wereld, op het Indonesische eiland Flores, ook een verrassende ontdekking: ze vonden de overblijfselen van een andere mensensoort met een klein chimpansee-achtig hoofd, die eveneens slechts enkele honderdduizenden jaren geleden leefde. Ze noemden de soort Homo floresiensis, maar door haar kleine gestalte is ze beter bekend onder haar bijnaam, de hobbit.

Onderzoekers debatteren al jaren over de plaats van Homo floresiensis in de menselijk stamboom. Onlangs hernam een studie het idee dat de oorsprong van de Floresmens kan teruggaan naar een zeer vroege, primitieve mensensoort die Homo habilis genoemd wordt, waarvan we weten dat ze leefde in Afrika meer dan 2 miljoen jaar geleden.

Het idee is dat een populatie van Homo habilis zo'n 2 miljoen jaar geleden Afrika verlaten heeft en langzaamaan doorheen Azië getrokken is, tot ze uiteindelijk Indonesië bereikt heeft. Als dit idee juist is, hoort Homo floresiensis thuis op een van laagste takken van de stamboom van de "echte mensen", ondanks zijn jonge leeftijd, omdat hij direct afstamt van de primitieve Homo habilis.

En dat zou betekenen dat soorten mensen die evolutionair gezien primitief zijn, in sommige omstandigheden in staat zouden kunnen zijn om honderdduizenden jaren lang te overleven.

Zekerheid over hoe Homo naledi aan zijn eind is gekomen, is er voorlopig nog niet. Maar als de fossielen echt slechts 300.000 tot 200.000 jaar oud zijn, is er al vast één mogelijk scenario.

Onze soort, de moderne mens Homo sapiens, verscheen in Afrika zo'n 200.000 jaar geleden. Als die moderne mensen korte tijd later het zuiden van Afrika bereikt hebben, hebben ze mogelijk bijgedragen aan het uitsterven van Homo naledi.

Ook hiervoor is er mogelijk een precedent. Uit het fossielenbestand blijkt dat Homo sapiens uit Afrika wegtrekt en zich langzaamaan verspreidt over Eurazië. Hierbij kwam Homo sapiens in gebieden die al bewoond werden door oude mensensoorten, soorten als de neanderthalers. En slechts enkele duizenden jaren na de aankomst van Homo sapiens in die nieuwe gebieden verdwijnen de inheemse oude mensensoorten, die blijkbaar de concurrentie met Homo sapiens niet aankonden. 

Zelfs de hobbit, Homo floresiensis, schijnt ditzelfde lot ondergaan te hebben. Uit de meest recente informatie blijkt dat de Floresmens 50.000 jaar geleden uitstierf, rond de tijd dat Homo sapiens in dit deel van Indonesië arriveerde. 

Misschien valt Homo naledi de twijfelachtige eer te beurt dat hij de eerste oude mensensoort is die tot uitsterven is gebracht door de verspreiding van onze soort. Maar voorlopig is dit slechts speculatie, en mogelijk zal het dat ook blijven en krijgen we nooit zekerheid over het uitsterven van Homo naledi.