Wanneer Larry Daley met enige tegenzin een baan als nachtbewaker in het Historisch Museum aanneemt, ontdekt hij al snel dat hij wel eens een cruciale rol in de wereldgeschiedenis kan gaan spelen. 's Nachts gebeuren er in het museum wel heel eigenaardige dingen... alles en iedereen komt tot leven! Met de waarschuwende woorden 'kaat niets binnen of buiten' in het achterhoofd en met de hulp van het beeld van president Roosevelt probeert Larry de vechtende Romaanse gladiatoren en Amerikaanse cowboys te verzoenen en uit de klauwen te blijven van de rondrennende T-Rex. Kan Larry het museum de baas?