Na jarenlang afgeschermd te zijn geweest van de mensenwereld, besluiten de Turtle-broers, door heldhaftige daden te verrichten, om de harten van New Yorkers te veroveren en geaccepteerd te worden als normale tieners. Hun nieuwe vriendin April O'Neil helpt hen om een mysterieuze misdaadsyndicaat aan te pakken, maar al snel raken ze in de problemen wanneer een leger mutanten op hen wordt losgelaten.
Wanneer een nieuwe dreiging in Gotham alle experimentele technologieën begint te stelen, wordt Batman op de hoogte gebracht. Maar hij is niet de enige die interesse toont in dit probleem: ook de Teenage Mutant Ninja Turtles - broers Leonardo, Donatello, Raphael en Michelangelo - mengen zich in het gevecht. Als blijkt dat hun beide aartsvijanden The Shredder en Ra's Al Guhl hun krachten hebben gebundeld, besluiten Batman, Robin en Batgirl samen te werken met de Turtles.
Het is alweer enkele jaren geleden dat de vier ninja schildpadden hun aartsvijand Shredder het hoekje om hielpen. De broers zijn uit elkaar gegroeid, ondanks dat Splinter alle moeite doet om hen bij elkaar te houden. Wanneer ze oog in oog te staan met een leger van prehistorische creaturen en oude vijanden zijn onze vrienden opnieuw op elkaar aangewezen... Cowabunga dudes! Wanneer New York City wordt bedreigd, is de hulp van de Turtles meer dan welkom. Maar Raphael, Donatello en Michelangelo weten niet meer wat zij moeten doen. Het is nu aan Leonardo en zen-meester Splinter om hen weer op het juiste pad te krijgen en de Ninja Turtles in ere te herstellen.
De film begint in het 2003-universum. Een gevecht tussen de Paarse Draak-straatbende en de Turtles wordt vastgelegd op film, maar wanneer deze later op tv wordt uitgezonden beweren alle vier de turtles (die uit het 2003-universum) niks af te weten van deze vechtpartij. Ze breken in bij het hoofdkwartier van de Paarse Draken om deze 'dubbelgangerturtles' te vinden, maar ontdekken dat de dubbelgangers wel degelijk echte Turtles zijn; namelijk alternatieve versies van hen uit het 1987-universum. De andere Turtles beweren in het 2003-universum te zijn beland door toedoen van hun aartsvijanden; Shredder en Krang. Ook hun mobiele fort, de Technodrome, is in het 2003-universum beland. Wanneer Shredder de acht turtles samen ziet, beseft hij dat er mogelijk ook alternatieve versies van hemzelf bestaat. Hij besluit de Shredder uit het 2003-universum, de Utrom Ch'rell, op te sporen in de hoop dat hij zijn bondgenoot kan worden. Utrom Ch'rell wil alle Turtles in alle dimensies vernietigen...
Wonend in de riolen had hij alleen ratten als vrienden. Op een dag vond hij vier schildpadden die per ongeluk in het riool waren beland. Toen Yoshi een keer terugkeerde van zijn verkenning door New York vond hij de schildpadden bedekt met een vreemd groen slijm. Dit veranderde hen in een kruising tussen wat ze oorspronkelijk waren, en een levensvorm waarmee ze recentelijk in contact waren gekomen. De turtles waren in contact gekomen met Yoshi en veranderden zo in mensachtige schildpadden. Yoshi was recentelijk in contact gekomen met een rat en veranderde in een mensachtige rat. Hierna nam hij het pseudoniem Splinter aan. Dit, en de versie van Archie Comics, zijn de enige incarnaties van de TMNT waarin Splinter en Yoshi een en dezelfde zijn. Dit is ook de enige incarnatie waarin de Turtles al direct na hun mutatie volledig volgroeid zijn, terwijl ze in alle andere incarnaties na hun transformatie nog kinderen zijn en door Splinter worden opgevoed.
