Sinds Mary-Jane Watson (Kirsten Dunst) op het einde van het tweede deel uit de Spiderman-saga Peter Parkers Grote Geheim heeft ontdekt, gaat het Peter terug allemaal voor de wind. Het publiek draagt hem op handen, zijn studies lopen weer vlot en ook financieel kan hij het best rooien. Alleen weet Harry Osborn (James Franco), die het masker en het Goblinkostuum van zijn vader (Willem Dafoe) heeft overgenomen, nu zijn geheime identiteit, en probeert hij Peter van kant te maken. Gelukkig voor Peter krijgt Harry tijdens een spectaculair luchtgevecht een klap tegen zijn kop, en het daaraan verbonden geheugenverlies.

Maar dan begint het allemaal verkeerd te kopen: MJ's carrière op Broadway is na één avond al zo goed als voorbij na een vernietigende kritiek, wanneer Spidey Gwen Stacy (Bryce Dallas Howard) de domme blonde dochter van politiecommissaris Stacy (James Cromwell) redt wordt MJ zo jaloers op haar dat Peters huwelijksaanzoek in het water (of in de champagne) valt, en tot overmaat krijgt Spidey niet af te rekenen met één, niet twee maar drie nieuwe, formidabele vijanden. De eerste is Flint Marko (Thomas Haden Church), een crimineel die, na het heropenen van het dossier over de moord op Ben Parker de echte moordenaar van Peters oom blijkt te zijn. Marko is het slachtoffer geworden van een wetenschappelijke proefneming waardoor hij in een morphende hoop zand is veranderd, waardoor hij fysiek nagenoeg onkwetsbaar is. Ook Harry is intussen terug bij zijn zinnen gekomen, en heeft zich voorgenomen om nog iets ergers te doen dan Peter te vermoorden, namelijk zijn liefje afpakken. De derde vijand is mogelijk nog minder tastbaar. Een in de buurt neergeslagen meteoriet bevat een symbiont die bezit neemt van de (rode) Spiderman, en zijn persoonlijkheid zodanig aantast dat de nieuwe, van een flashy nieuw zwart kostuum voorziene Spiderman door de straten van New York slingert, maar dan één die een veel grotere eigendunk heeft, veel aggressiever is en duidelijk minachting heeft voor alle lagere levensvormen.

2007